D.W. Hollomon
Departamento de Ciências Agrícolas, University of Bristol, IACR Long Ashton Research Station, Long Ashton, Bristol, BS 41 9AF, UK

INTRODUÇÃO

Os fungicidas são importantes ferramentas para o controle das principais doenças das plantas em sistemas intensivos de produção de culturas, e assim continuarão por muito tempo. Devido ao volume de investimentos públicos e privados em pesquisas para lançar novos fungicidas no mercado e à sua função principal de assegurar a produção rentável de culturas de alimentos e fibras, é preocupante que sua performance possa declinar em decorrência do desenvolvimento de resistência nos fungos alvo. Embora a resistência resulte da seleção de mutações raras em populações de patógenos, é possível gerenciar a resistência de forma efetiva, contando com conhecimento suficiente sobre os mecanismos de resistência, bons procedimentos de monitoramento e acesso a produtos com diferentes modos de ação. Na verdade, até hoje nenhum grupo de fungicida foi perdido unicamente devido à resistência. Entretanto, a estimativa do risco de resistência a novos compostos durante seu desenvolvimento é um conceito difícil, e sem dúvida ainda não constitui uma ciência exata.

A estimativa de risco foi recentemente avaliada em mais detalhes por Brent & Hollomon (1998). Deve ser um programa contínuo iniciado na fase inicial do desenvolvimento de um novo produto e continuar durante o uso comercial. Mas os novos fungicidas somente são introduzidos após extensivos ensaios de campo terem determinado sua eficácia e, portanto, pode-se presumir que as populações alvo iniciais são sensíveis. Caso a seleção intensiva gere resistência, diversos fatores chave terão influência na determinação dessa possibilidade.

· A resistência é genética e bioquimicamente possível?
· A freqüência de indivíduos resistentes pode aumentar?
· Há ferramentas adequadas para monitorar a resistência?

MECANISMOS GENÉTICOS E BIOQUÍMICOS DA RESISTÊNCIA

A resistência é transmitida geneticamente e resulta de uma ou mais mutações no fungo alvo. Quando a resistência se torna um problema prático, as mutações geralmente provocam uma alteração no sítio alvo bioquímico, fazendo com que a ligação do fungicida seja menos efetiva, ou até que não ocorra. Essas mutações gênicas principais resultam em altos níveis de resistência e, embora a grande maioria esteja associada a alguma dificuldade de adaptação, ou mesmo letalidade, nem sempre isso acontece. As mutações podem ocorrer em genes nucleares ou, como no caso dos fungicidas estrobilurinas recentemente introduzidos, em genes codificados mitocondrialmente. Quando está envolvida resistência de gene principal, a recombinação genética entre os parentais resistentes e os não mutantes gera duas classes distintas de progênie (Figura 1), e nenhuma progênie com sensibilidade intermediária. A seleção para resistência de gene principal geralmente resulta em um rápido declínio da eficiência.

A resistência em muitos patógenos é bioquimicamente possível, embora em diversos casos somente seja estudada em mutantes resistentes gerados em laboratório. A natureza exata das alterações dos amino ácidos nas proteínas alvo que causam resistência somente é conhecida no caso dos fungicidas benzimidazóis, DMI e estrobilurina ( Davidse & Ishii, 1995; Delye et al., 1998; Koeller, 1999; Gisi et al., 2000; Sierotski et al., 2000). Foram reportados altos níveis de resistência a estrobilurina e fungicidas similares (QOIs - anteriormente grupo STAR) em diversos fungos (Tabela 1), e a análise da seqüência pelo menos de fragmentos parciais do gene alvo citocromo bc-1 codificado mitocondrialmente, sugere que a resistência está ligada a uma mutação de ponto (G143A). Nesse caso, a glicina é substituída por uma alanina levemente maior na região da proteína envolvida na ligação dos fungicidas QOI, e próxima ao centro Qo. Não está claro como isso afeta a conformação do citocromo alvo, ou mesmo da proteína ferro-enxofre adjacente. Até o momento também não há qualquer evidência bioquímica que confirme que essa mutação G143A altere a ligação do fungicida. Diferenças sutis entre estrobilurinas e oxazoleidinedione, famoxate, podem afetar os padrões de resistência cruzada entre os fungicidas QOI, mas pelo menos alguns desses fungos resistentes parecem tão adaptados como os não mutantes e presume-se que o transporte de elétrons através do centro Qo não seja afetado (Sierotski et al., 2000).

Outros mecanismos, além de alterações no local alvo, podem provocar resistência. A desintoxicação metabólica de fungicidas raramente é encontrada, talvez porque os fungos não possuem mecanismos de excreção e enzimas necessárias para gerar metabólitos polares que possam ser expelidos por vias aquosas. Mas como os outros organismos, os fungos possuem um sistema de proteínas que transpõe a membrana e que está envolvido tanto na absorção de nutrientes como no efluxo de moléculas indesejáveis. O efluxo requer energia, especialmente quando os fungicidas solúveis em lipídios são expelidos por uma membrana de lipídio e contra um gradiente de concentração. O aumento de efluxo de fenarimol de mutantes resistentes Aspergillius nidulans foi revertido pelo desacoplador da fosforilação oxidativa CCCP, e os mutantes se tornaram sensíveis (DeWaard & van Nistelroy, 1979). Esses mecanismos de efluxo não são seletivos e podem gerar resistência cruzada a fungicidas com diferentes modos de ação. Na medicina esse mecanismo é conhecido como Resistência a Múltiplas Drogas (MDR) e é responsável pelo fracasso de uma ampla gama de antibióticos e agentes anti-fúngicos. Mas não está claro em que extensão esse mecanismo de efluxo contribui para a resistência a fungicidas na prática. É a causa da resistência a DMIs em algumas raças de C. albicans, em que alterações no local alvo não são tão importantes mas, ao contrário, transportam proteínas que expelem diferentes compostos em maior quantidade após o tratamento com fungicida (Bauer et al., 1999; Cowen et al., 2000). Entretanto, o aumento da expressão dos transportadores não foi relacionado conclusivamente à resistência a fungicidas na prática, embora esses mecanismos possam contribuir para baixos níveis subjacentes de resistência. Na verdade, em nenhum dos casos em que os fungicidas fracassaram contra patógenos de plantas devido a resistência, a resistência cruzada estendeu-se além dos compostos com o mesmo modo de ação.
A produção excessiva da proteína alvo é um outro possível mecanismo de resistência. Embora nem sempre provoque resistência na prática, em raças de Penicillium digitatum resistentes a DMI no campo, a expressão constitutiva da proteína alvo esterol 14a demetilase foi cerca de 100 vezes maior que nas raças não mutantes sensíveis, o que foi relacionado a uma alteração na região promotora do gene, que pela produção do RNA mensageiro relacionado, determina a quantidade de proteína alvo produzida (Hamamoto et al., 2000). Um outro mecanismo que pode causar resistência em mutantes de laboratório envolve um caminho metabólico alterado que evita o local alvo porém, também nesse caso, não está comprovado que seja responsável pela resistência em populações de patógenos de plantas.

Apesar de não causar resistência na prática, os efeitos dos diversos genes envolvidos podem ser aditivos e juntos podem resultar em alterações perceptíveis da sensibilidade e amplificar o efeito de uma alteração no local alvo. A recombinação permite a reclassificação dos diversos fatores envolvidos e geralmente resulta em progênie com sensibilidade intermediária à dos parentais (Figura 1). Quando a resistência é controlada por diversos genes, a seleção estabilizadora coloca a sensibilidade da população em torno de uma média, não necessariamente refletindo o nível mais alto de resistência. Inicialmente, a seleção gera uma ampla gama de sensibilidade, mas subseqüentemente os extremos da distribuição da população são perdidos. No momento, os bioensaios são a única forma prática de monitorar essas alterações, e embora a resistência cruzada subjacente reflita um único mecanismo de resistência e siga os modos de ação, os fatores de resistência dos diferentes análogos podem diferir substancialmente. Conseqüentemente, a resistência múltipla, que envolve mais de um mecanismo de resistência e geralmente fungicidas de diferentes grupos de modo de ação, também pode ocorrer entre fungicidas que agem da mesma forma sendo que os diversos mecanismos contribuem para a resistência. Alterações múltiplas que provocam resistência estabelecem-se mais gradualmente e freqüentemente podem ser revertidas quando a seleção é suprimida. Por exemplo, a resistência a triadimenol rapidamente se tornou um problema prático para o controle de mancha foliar em cevada, causado por Rhynchosporium secalis, mas os fatores de resistência para outros DMIs foram mais baixos e inicialmente esses DMIs continuaram muito eficientes (Kendall et al., 1993). Porém, gradativamente, a resistência a esses DMIs difundiu-se para as populações de patógenos e sua eficácia também declinou.

É possível que alguns alvos bioquímicos apresentem baixo risco de resistência. Há fungicidas cujos mutantes resistentes podem ser gerados em laboratório, ou mesmo encontrados em populações de campo, mas sua freqüência é baixa. O novo fungicida quinoxyfen interfere de alguma forma com a sinalização da proteína G que controla as etapas iniciais da infecção de oídio (Wheeler et al., 2000). Os componentes desse percurso de sinalização geralmente são multifuncionais, e as mutações podem ter diversos efeitos pleiotrópicos. As raças resistentes a quinoxyfen podem ser geradas em populações de oídio (E. graminis f.sp. hordei) em laboratório e podem ser isoladas no campo, mas não foi detectado aumento na freqüência dessas raças resistentes em resposta à seleção, apesar de extensivo monitoramento da sensibilidade.

Parece, também, que a organização genômica tem um impacto sobre o risco quando a resistência é controlada por um gene principal. As mutações de ponto, seja em fungos haplóides ou poliplóides, em que talvez todos os núcleos são iguais, apresentam risco de moderado a alto (Figure 2). Mas em dicariontes, onde os dois núcleos são de parentais diferentes, o risco é baixo, conseqüentemente, a resistência ao fungicida tem sido um problema apenas raramente encontrado em ferrugens, apesar do uso intensivo especialmente de DMIs, e mais recentemente QOIs, para controlá-las. Algumas mutações nos genes mitocondriais alvo também geram resistência facilmente, talvez por não ter a mitocôndria nenhum mecanismo de recuperação do DNA, ou o tamanho menor do genoma assegurar que as mutações afetam a função da proteína mais rapidamente que nos genes nucleares.

Apesar de um único sítio de ação, as dificuldades que cercam a produção em laboratório de mutantes resistentes de patógenos de plantas resultou em uma estimativa preliminar de risco moderado para os fungicidas estrobilurina. O surgimento de resistência prática significativa em oídio (Chin et al., 2001) e míldio (Ishii et al., 1999) em algumas partes do mundo nos dois primeiros anos de uso extensivo resultou na revisão do risco de resistência desses patógenos a estrobilurinas de moderado para alto. Fatores inerentes associados a doenças também influenciam o risco de resistência (Figura 3 ). Patógenos que têm gerações de períodos curtos e esporulação extensiva podem provocar epidemias explosivas, exigindo aplicações freqüentes de fungicidas e, conseqüentemente, maior risco de resistência que os patógenos que têm apenas uma geração por ano (como os carvões). O tratamento de epidemias isoladas em estufas ou túneis plásticos aumenta o risco de resistência, pois a diluição por indivíduos não mutantes sensíveis é mantida ao mínimo. As respostas aos fungicidas pelos diferentes patógenos, nas diferentes partes do mundo, podem modificar as estimativas de risco.

A FREQÜÊNCIA DE INDIVÍDUOS RESISTENTES PODE AUMENTAR?

Quando um novo fungicida é desenvolvido, os indivíduos resistentes devem ser raros, caso contrário a eficiência não seria suficiente para a obtenção do registro. Como as populações de doença são extremamente grandes, ocorrerão todas as mutações resistentes possíveis. Muitas serão letais, mas algumas sobreviverão e aumentarão em freqüência pela seleção darwiniana com a aplicação dos tratamentos. Caso a adaptabilidade relativa dessas mutações não melhore, sua freqüência novamente declinará quando a seleção ceder, e a competição com indivíduos não mutantes será restabelecida. Raramente isso ocorre quando a resistência se tornou um problema prático, e a população não mutante original pode precisar de anos para se restabelecer.
A resistência gerada no laboratório não é restringida por limitações de adaptabilidade, podendo-se obter mutantes resistentes que jamais são isolados das populações de campo. As mutações de ponto em 10 locais diferentes no gene ß-tubulina confere resistência aos fungicidas benzimidazóis, mas apenas dois deles são comumente encontrados na prática, e somente envolvem algumas das possíveis alterações do amino ácido (Hollomon et al., 1997). Diversas mutações são associadas a dificuldades funcionais, embora seja difícil prever quais mutações serão bem sucedidas e provocarão resistência prática. O conhecimento dos valores ED50, ou de qualquer outra medida da sensibilidade do fungicida, não é suficiente para prever a evolução da resistência com os diferentes tratamentos (O'Hara et al., 2000). A adaptabilidade bioquímica deve ser combinada com a adaptabilidade patogênica antes que a resistência possa se tornar um problema, mas a experiência sugere que pode ocorrer de forma surpreendentemente rápida dependendo da biologia dos organismos envolvidos.

HÁ FERRAMENTAS ADEQUADAS PARA MONITORAR A RESISTÊNCIA?

Dada a natureza conservada de muitos alvos de fungicidas, talvez não seja surpreendente que a mesma mutação provoque resistência em diferentes patógenos. Uma conseqüência de alterações conservadas no sítio alvo é que a resistência cruzada abrange todos os fungicidas que têm o mesmo modo de ação, sendo o teste da resistência cruzada para compostos existentes uma importante etapa inicial na estimativa de risco. A natureza conservada de alterações no sítio alvo também significa que após a resistência ter sido identificada, talvez por meio de um programa de rastreamento de mutação utilizando um sistema de diagnóstico moderno baseado em PCR, as mutações de ponto podem ser pesquisadas em populações de campo de outros patógenos e detectadas em freqüências muito menores que aquelas facilmente atingidas em bioensaios.

Em conjunto com o próbite e outros métodos para análise de dados, o bioensaio há muito é a base para a monitoramento da resistência. Sua principal vantagem é que mede a resistência independente dos mecanismos que com ela contribuem. Os bioensaios são facilmente adaptáveis e podem ser aplicados à maior parte dos sistemas, desde que a resposta medida seja relevante para a ação do fungicida. Os efeitos sobre a germinação dos esporos são uma forma rápida de monitorar a sensibilidade do fungicida, mas podem ser equivocados quando o fungicida não tem efeito sobre a germinação, mas atua em um estágio posterior do desenvolvimento. Os componentes do meio usado no bioensaio não devem afetar o resultado. Os fungicidas anilinopirimidina interferem de alguma forma na biossíntese de alguns amino ácidos (Masner et al., 1994; Fritz et al., 1997) e sua inclusão em qualquer meio de bioensaio resulta na diminuição da sensibilidade do fungo de até 50 vezes (Pseudocercosporella herpotrichoides = Tapesia yallundae, Babij et al., 2001).

As principais desvantagens dos bioensaios referem-se ao elevado consumo de recurso e ao fato de não identificarem o genótipo (alelo) que provoca a resistência. Quando há vários mecanismos que contribuem com a resistência, são necessárias diversas doses para obter informação suficiente para gerar relações significativas dose/resposta e valores ED50, ED95, ou outras medidas de sensibilidade. Quando o nível de resistência é elevado, apenas uma dose de diferenciação pode ser suficiente, mas o mecanismo envolvido não será necessariamente identificado. Todavia, o bioensaio é a única solução prática quando os mecanismos não são conhecidos.

Mas quando os mecanismos são conhecidos, os métodos bioquímicos e aqueles baseados no DNA superam as desvantagens do bioensaio. Infelizmente, tentativas de desenvolver ensaios enzimáticos e imunológicos ainda não foram bem sucedidas. Ao contrário, a ênfase tem recaído sobre as técnicas de PCR disponíveis para identificar mutações de ponto relacionadas à resistência. Os ensaios são facilmente automatizados, permitindo que centenas de amostras sejam testadas diariamente, mas por enquanto constituem ferramentas de pesquisa e não estão disponíveis comercialmente.
Quando uma mutação de resistência gera um novo sítio de restrição, a digestão de um produto de PCR com essa enzima de restrição identifica a resistência (Sierotski et al., 2000). Mas talvez o método PCR mais simples é o que utiliza primers específicos (Oligonucleotídeos Alelo-Específicos, ASO) que somente geram um produto de PCR quando há uma combinação perfeita com a seqüência alvo. A Figura 4 mostra um exemplo da detecção da mutação Y136F no gene esterol 14a demetilase (CYP51) em oídio da cevada, que está ligado a determinados níveis de resistência a DMI (Delye et al., 1998). Desenhando-se dois primers com o par de bases não pareados na extremidade 3' e usando um primer comum em sentido oposto, os alelos resistentes e sensíveis podem ser identificados usando-se apenas um pedaço de 2 cm de folha infectada como amostra. Essa folha pode ser mantida congelada antes do uso. No experimento mostrado na Figura 4, um par de primers não-específico foi incluído, o qual amplifica um fragmento de PCR maior, e é usado como controle para confirmar que a reação PCR realmente funcionou corretamente (Fraaije et al., 2000). Usando-se somente o par de primers ASO, a amplificação é restrita a um único produto de PCR característico da resistência. Marcadores de cianina, como PicoGreen e o termoestável SYBR1 Green, que apenas produzem fluorescência quando ligado ao DNA dupla-fita, permitem medições diretas de fluorescência da reação PCR para identificar rapidamente um resultado positivo, evitando maior manipulação envolvendo eletroforese em gel. Esses métodos baseados em PCR não são facilmente quantificáveis, mas recentes desenvolvimentos em PCR em Tempo Real, e técnicas de hibridização específica com sondas Taqman® ou "molecular beacons" (Tapp et al., 2000), permitem a medição precisa da freqüência de mutações resistentes e de alterações resultantes da seleção (Figura 5). Os diferentes fluoróforos incorporados a cada sonda ou beacon, oferecem o potencial de monitorar mais que uma mutação em uma única reação PCR. Essas técnicas são extremamente específicas e oferecem informações sobre as freqüências de alelos que podem ser diretamente incorporadas em modelos genéticos de população oferecendo prognósticos de diferentes estratégias de tratamento. Entretanto, são necessárias precauções para interpretar esses dados. As raças que mostram-se resistentes no bioensaio, mas que têm uma mutação diferente daquela incluída no primer/sonda, ou que têm um mecanismo de resistência totalmente diferente, serão identificadas como sensíveis.

Uma dificuldade apresentada por todos os métodos de monitoramento é o protocolo de amostragem necessário para a obtenção de valores precisos para o nível de resistência em qualquer população. O tamanho da amostra também é importante, mas depende em grande parte do objetivo do exercício de monitoramento. A freqüência inicial de resistência é um dos diversos parâmetros chave para prever como a resistência pode distribuir-se em uma população. A Figura 6 mostra que a identificação por bioensaio de uma freqüência inicial de 1 : 10-3 exige um aporte significativo de recursos e a pesquisa de 1 : 10-6 ou 1 : 10-8 é impossível. As tecnologias de PCR oferecem a possibilidade de detecção de mutações de resistência em freqüências muito mais baixas e em uma fase muito anterior que com o bioensaio. Por outro lado, a mutação que confere resistência a estrobilurina em oídio do trigo pode ser detectada em freqüências inferiores a 1 : 10-4, e esses ensaios de PCR podem ser realizados em um único dia, sendo que para desenvolver e conduzir bioensaios com isolados de oídio o tempo necessário pode ser superior a um mês. Durante uma epidemia, podem ser conduzidos diversos ensaios de PCR, podendo ser detectadas freqüências globais de alelos resistentes inferiores a 1 : 10-6. Os dados dos ensaios de PCR relacionam-se a freqüências de alelos, e não a freqüências fenotípicas de indivíduos isolados. A característica de sensibilidade dos ensaios de PCR também pode revelar um nível de fundo do alelo não mutante em populações resistentes.

Um exercício de monitoramento útil é a determinação da distribuição da linha base da sensibilidade antes da introdução de um fungicida. Caso ocorra resistência subseqüentemente, qualquer nova população pode ser comparada à distribuição da linha base para confirmar se as dificuldades de eficiência realmente resultam da resistência. O tamanho da amostra necessário para essas comparações depende de diversos fatores, incluindo a magnitude da resistência esperada e do erro experimental associado ao método do ensaio. Por exemplo, uma mudança de dez vezes na sensibilidade no patógeno da sarna da maçã (Venturia inaequalis) ao fungicida flusilazole pode ser confirmada com uma amostra de apenas 50 indivíduos (Smith et al., 1991).

CONCLUSÕES

A resistência ameaça enfraquecer nossa capacidade de controlar diversas plantas daninhas, pragas e doenças importantes. Para os fitopatologistas, o problema ocorreu pela primeira vez na década de 1960 após o uso generalizado de benomyl, mas as pesquisas em cooperação representando os interesses privados e públicos, foram bem sucedidas para o controle do problema e evitaram graves prejuízos. Além de novos químicos, isso foi alcançado com a maior compreensão dos mecanismos da resistência e dos fatores inerentes associados às doenças e fungicidas específicos que podem contribuir com a resistência. Embora a estimativa e o gerenciamento do risco sejam ciências imprecisas, o conhecimento é suficiente para o desenvolvimento de esquemas práticos que minimizem o risco de resistência. Soma-se a essa base de conhecimento um processo contínuo que somente pode melhorar a capacidade de gerenciar o problema da resistência. A descoberta da resistência a um novo fungicida não implica em que está descartado. Simplesmente esclarece como o fungicida pode ser usado de forma sustentável no futuro.

AGRADECIMENTOS

O IACR recebe contribuição do Biotechnology and Biological Sciences Research Council do Reino Unido.

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TABELA 1

Situação atual da resistência a estrobilurina (QOI) na prática.

Patógeno	Doença	Distribuição
Erysiphe (=Blumeria) graminis f.sp. tritici	Oídio (trigo)	N. da Europa
Erysiphe (=Blumeria) graminis f.sp hordei	Oídio (cevada)	Escócia
Sphaerotheca fuligenea	Oídio (abobrinha)	Ásia Or., Espanha
Psuedoperonospora cubensis	Míldio (abobrinha)	Japão
Plasmopara viticola	Míldio (uva)	França, Itália
Mycosphaerella fijiiensis	Sigatoka negra (banana)	Costa Rica
Venturia inaequalis	Sarna (maçã)	Alemanha

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